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甲氨蝶呤片作為一種葉酸還原酶抑制劑，主要抑制二氫葉酸還原酶而使二氫葉酸不能還原成有生理活性的四氫葉酸，從而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成過程中一碳基團的轉移作用受阻，導致DNA的生物合成受到抑制。甲氨蝶呤片適用于各型急性白血病，特別是急性淋巴細胞白血病、惡性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤和蕈樣肉芽腫、多發性骨髓病等，療效確切；頭頸部癌、肺癌、各種軟組織肉瘤、銀屑??；乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、惡性葡萄胎、絨毛膜上皮癌、睪丸癌。
甲氨喋呤片可以用來治療青少年類風濕性關節炎，其總體療效良好。雖然輕微的青少年類風濕性關節炎有時會不治而愈，但嚴重者如多關節幼年型類風濕性關節炎常常會導致關節畸形甚至致殘，而常規消炎鎮痛劑對這類患兒往往不夠。臨床試驗研究結果發現，甲氨喋呤片的這一療效要比成人患者的治療更為顯著，且患兒的耐受性普遍良好。
大劑量的甲氨蝶呤片是防治兒童急性淋巴細胞白血病髓外浸潤和全身鞏固治療的有效措施，但不良反應較多。通過檢測甲氨蝶呤血清濃度，在恰當時間應用恰當劑量四氫葉酸鈣解救，可減輕不良反應并增加療效。
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