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亞葉酸是四氫葉酸(THF)的5-甲酰衍生物的非對映異構體混合物，其生物活性物質為左旋體稱為左亞葉酸。
亞葉酸不需要經過二氫葉酸還原酶的還原作用而直接參與使用葉酸作為體內轉移“一碳基團”載體的生物反應。L–亞葉酸(L-5甲酰四氫葉酸)快速代謝(依次為5,10-甲基四氫葉酸，5,10-亞葉酸四氫葉酸)為L-5-甲基四氫葉酸。L-5-甲基四氫葉酸能夠通過其他途徑代謝為5，10-亞甲基四氫葉酸，5，10-亞甲基四氫葉酸通過PDAH2和NADPH輔酶的催化還原，不可逆地轉化為5-甲基四氫葉酸。
使用亞葉酸能夠抵消抑制二氫葉酸還原酶的鹽酸拮抗劑(例如甲氨蝶呤)的治療效果和毒性。亞葉酸能夠增強氟嘧啶(如5-氟尿嘧啶)在腫瘤治療中的療效和毒性作用。同時使用亞葉酸似乎并不改變5-氟尿嘧啶在血漿中的藥代動力學過程。5-氟尿嘧啶在體內代謝為脫氧氟尿嘧啶核苷酸，結合并抑制胸苷酸合成酶(該酶在DNA修復和復制中十分重要)。
亞葉酸在體內很容易轉化成5，10-亞甲基四氫葉酸，該轉化物能夠穩定脫氧氟尿嘧啶核苷酸與胸苷酸合成酶的結合，進而增強對該酶的抑制作用。毒理研究大鼠和兔的生殖毒性研究顯示，亞葉酸鈣注射液在人用劑量的至少50倍時，未見胚胎毒性。
國外臨床研究中，63例直腸癌患者使用了亞葉酸鈣注射液，結果顯示亞葉酸鈣注射液不良反應包括嘔吐(86.36%),感覺神經毒性(51.82%),脫發(10.00%)，運動神經毒性(3.64%)，口腔黏膜炎(2.73%),發熱(1.82%)。上述不良反應以Ⅰ級和Ⅱ級為主。Ⅲ級不良反應包括惡心、嘔吐、發熱和感覺神經毒性反應。實驗室檢查異常主要包括白細胞減少、中性粒細胞減少、白細胞數減少(60.7%)，血紅蛋白減少(40.5%)，總蛋白降低(14.5%)。
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